CRISPR/Cas9 Mutagenesis through Introducing a Nanoparticle Complex Made of a Cationic Polymer and Nucleic Acids into Maize Protoplasts. – INT J MOL SCI. 2023 NOV 9;24(22):16137. doi: 10.3390/ijms242216137.

Kationos polimer és nukleinsav komplexek alkalmazhatósága a precíziós nemesítés tükrében

A génszerkesztéssel végzett precíziós nemesítés egyre nagyobb figyelmet kap mind a klímaváltozás elleni harcban, mind a fenntarthatóbb mezőgazdaság érdekében folytatott küzdelemben. A specifikus és gyors módszerrel végzett nukleotidszintű, irányított DNS-változtatások sikeressége nagymértékben függ azonban a folyamathoz szükséges molekulák növényi sejtekbe történő bejuttatásának hatékonyságától.

A kutatócsoport saját készítésű, pozitív töltésű ún. poli(2-hidroxipropilén imin) (PHPI) polimert szintetizált. A polimer részecskék és a vele bejuttatásra szánt DNS molekulák optimális keverési arányával az általuk formált komplex pozitív töltése lehetővé tette, hogy a negatív töltésű sejtmembránokkal kölcsönhatásba lépve a kívánt molekuláik a sejtek belsejébe továbbítódjanak. Ezeket a nanorészecske komplexeket használva így sikeresen juttattak be plazmid DNS, továbbá fluoreszcensen jelölt rövid nukleinsavakat, oligonukleotidokat is sejtfal nélküli kukorica sejtekbe, ún. protoplasztokba. Kísérleteik során a legnagyobb transzformációs hatékonyság elérése érdekében elsőként számos paramétert optimalizáltak: a „nanorészecske együttesek” építőköveiként szolgáló polimer/plazmid és polimer/oligonukleotid arányok meghatározása mellett a komplexek és a kukorica célsejtek leghatékonyabb inkubálási idejét is megállapították, valamint a DNS bejuttatáshoz szükséges ideális ozmotikus körülményeket is vizsgálták. A felhasznált fluoreszcens molekulák lehetővé tették, hogy konfokális mikroszkópiával igazolják a sejtmembránokon keresztül továbbított molekulák sejtmagi felhalmozódását, alátámasztva ezáltal a módszer növényi sejteken történő alkalmazhatóságát. A folyamat tökéletesítése után a nanorészecske használatával a kutatók sikeresen alkalmazták a CRISPR/Cas9 „genetikai olló” módszerét a zölden fluoreszkáló fehérjét biztosító GFP marker gén kikapcsolására is. A már „nem világító” sejteken végzett analízissel rövid módosításokat igazoltak a GFP gén nukleotid sorrendjében, melyek elsősorban egy-egy pontmutációt, kis inszerciót (azaz nukleotidtöbblet) vagy kis deléciót (nukleotidhiányt) jelentettek, hozzájárulva ezáltal a kívánt gén kiiktatásához, elcsendesítéséhez. Munkájuk folytatásaként a kukorica szárazságtűrésének javításában szerepet játszó különböző gének precíziós szerkesztésére kívánják tovább alkalmazni, lehetőség szerint továbbfejleszteni módszerüket.